На правах рукописи тамбовцев константин Александрович влияние синтетических феромонов на развитие и жизнедеятельность пчел




На правах рукописи


ТАМБОВЦЕВ

Константин Александрович


ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ФЕРОМОНОВ

НА РАЗВИТИЕ И ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ПЧЕЛ


03.03.01 – физиология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Рязань – 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Бирской государственной социально-педагогической академии и Учреждении Российской академии наук Институте органической химии Уфимского научного центра РАН


Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, доцент

^ Ишмуратова Наиля Мавлетзяновна


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Каширина Лидия Григорьевна

доктор биологических наук, профессор Крылов Василий Николаевич

доктор сельскохозяйственных наук, профессор ^ Козин Роберт Борисович


Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Чувашская государственная

сельскохозяйственная академия», г. Чебоксары


Защита диссертации состоится «25» октября 2011 г. в «10.00» часов на заседании диссертационного совета Д 220.057.01 при ФГОУ ВПО «Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева» по адресу: 390044, г. Рязань, ул. Костычева, д. 1,

e-mail: disert@rgatu.ru


Автореферат размещен на сайте referat_vak@obrnadzor.gov.ru


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева»


Автореферат разослан «___»_________________ 2011 г.


Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук А.С. Емельянова

^ 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. В любой стране, в том числе и в Российской Федерации, первостепенное значение придается решению Продовольственной программы, интенсификации всех отраслей сельскохозяйственного производства. Другим важным аспектом социальной политики является расширение и совершенствование мероприятий по охране природы и здоровья человека. Эти тесно связанные между собой проблемы общемирового значения сегодня могут быть решены только с использованием передовых и прогрессивных методов сельского хозяйства.

Одной из главных задач современного пчеловодства является поиск экологически чистых и безопасных препаратов для повышения продуктивности, оздоровления пчелиных семей и уменьшения трудозатрат при их содержании. Внимание ученых и практиков все больше привлекают препараты, созданные на основе природных биологически активных веществ и применяемые для стимулирования жизнедеятельности, повышения иммунитета, устойчивости к стрессовым факторам и лечения заболеваний пчел. Особое место среди них занимают феромоны медоносных пчел и их полные синтетические аналоги, поскольку, являясь продуктами генетически запрограммированного метаболизма, они не токсичны, и у пчел не возникает к ним привыкания.

Поэтому проведение систематических исследований по изучению действия феромонов на физиологию медоносных пчел, поиску и разработке методов их использования с целью создания эффективных препаратов для сельского хозяйства, является актуальной проблемой современной биологии.

Целью данной работы явилось изучение влияния синтетически полученных феромонов медоносной пчелы (^ Apis mellifera L.) на жизнедеятельность пчелиных семей, создание и усовершенствование биологически и фармакологически активных препаратов для пчеловодства и методов их применения.

В соответствии с целью работы на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. с использованием теории феромонной коммуникации насекомых разработать композиции на основе синтетически полученных многофункционального феромона матки медоносной пчелы (9-оксо-2Е-деценовая кислота), компонентов железы Насонова (гераниол, цитраль, гераниевая кислота), аттрактанта медоносных пчел (13-гидрокси-2-оксотридекан) и компонента феромона расплода (глицерил-1,2-диолеат-3-пальмитат) и изучить их влияние на жизнедеятельность пчелиных семей:

- на разных стадиях роения;

- на физиологические показатели, стимуляцию развития и продуктивность пчелиных семей;

- на подсадку чистопородных среднерусских маток к семьям-помесям и посадку роев в улей;

- на возможность их тератогенного действия на расплод пчел;

- на реакцию трутней в условиях изолированного случного пункта;

- на пораженные варроатозом и болезнями расплода семьи пчел;


2. на основе полученных данных о влиянии феромонных композиций на физиологию пчелиной семьи, создать новые препараты, усовершенствовать известные и расширить область их применения.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института органической химии Уфимского научного центра РАН по теме: «Биорегуляторы поведения и жизнедеятельности насекомых: синтез и препараты на их основе» (Регистрационный № 01.99.0011834) при финансовой поддержке гранта «Направленный синтез веществ с заданными свойствами и создание функциональных материалов на их основе» (Госконтракт № 36) в рамках договоров о научно-техническом сотрудничестве с Башкирским государственным аграрным университетом, НИИ пчеловодства и Академией пчеловодства (г. Рыбное), Башкирской опытной станцией пчеловодства АН Республики Башкортостан, Государственным природным заповедником «Шульган-Таш».

^ 1.3. Научная новизна. С использованием теории феромонной коммуникации насекомых сформулировано и развито перспективное научное направление по изучению влияния феромонов на жизнедеятельность пчел и созданию препаратов для пчеловодства на основе синтетически полученных феромонов медоносной пчелы (Apis mellifera L.) (биологически активных компонентов маточного вещества, пахучей железы Насонова и феромона расплода), включающее разработку эффективных и экономичных синтезов 9-оксо- и 10-гидрокси-2Е-деценовых кислот и глицерил-1,2-диолеат-3-пальмитата, подбор оптимальных композиций препаративных форм и исследование их фармакологической активности на медоносных пчелах, и методов их применения.

Впервые для синтетического компонента многофункционального феромона – 9-ОДК – выявлены новые, ранее неизвестные значительные фармакологические свойства на медоносных пчелах: установлены противоварроатозное действие и антибактериальная и противогрибковая активность при гнильцовых заболеваниях и аскосферозе, что свидетельствует о выполнении «царицей» улья кроме уже хорошо известных функций и лечебной, которая, в свою очередь, прямо коррелирует с количеством 9-ОДК и, в конечном счете, с качеством матки.

Впервые показано, что при регулировании процесса роения с помощью феромонных препаратов роевые мисочки являются биологически активными точками (причем они не равнозначны) и наиболее важными из них являются мисочки с яйцами и личинками, которые наиболее часто посещаются пчелами.

^ 1.4. Практическая значимость. На основе синтетических компонентов маточного вещества медоносных пчел создан, запатентован и сертифицирован многофункциональный феромонный препарат ТОС-3 и разработаны способы его применения в качестве противороевого средства, для подсадки маток, улучшения продуктивных свойств пчелиных семей, усиления летной деятельности, увеличения массы новорожденных пчел и яйцекладки маток.

Установлено, что феромонный препарат ТОС-3 оказывает лечебное действие при европейском и американском гнильцах и аскосферозе, причем его применение в композиции с «ТОС-БИО» и йодинолом позволяет полностью избавиться от последнего.

Предложен экономичный и эффективный способ противороевой обработки внесением препарата ТОС-3 в роевые мисочки в начальной стадии роевого состояния пчелиных семей.

Найдены новые области применения запатентованного и сертифицированного феромонного препарата «Апимил» на основе биологически активных компонентов мандибулярных желез пчелиной матки и пахучей железы Насонова для стимуляции развития пчелиных семей, подсадки чистопородных среднерусских маток к семьям-помесям и в качестве противоварроатозного средства.

Создан и запатентован феромонный препарат «Апимил-М» на основе 9-оксо-2Е-деценовой кислоты, синтетических компонентов железы Насонова, и микродобавок летучих соединений, обнаруженных в теле рабочих особей медоносных пчел.

Разработан метод «планомерного роения», заключающийся в том, что пчелиные семьи после зимовки делятся на 2 группы (сильные и средние+слабые). В группе сильных пчелосемей используют роепривлекающие препараты «Апимил» и «Апимил-М», в другой группе применяют противороевой препарат ТОС-3.

Показано, что обработка препаратом ТОС-3 в начальной стадии роения способствует увеличению производства продукции на 88%, применение препарата «Апимил-М» повышает эффективность поимки вышедших роев в 3.1 раза.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. влияние препарата ТОС-3 на физиологические показатели и продуктивную деятельность рабочих пчел;

  2. более эффективный и рентабельный в практических условиях способ противороевой обработки пчелиных семей феромонным препаратом ТОС-3;

  3. увеличение (в 2 раза) облета обработанных препаратом ТОС-3 подсаживаемых в нуклеусы маток вследствие большей аттрактивности для трутней.

  4. эффективный и рентабельный способ стимуляции развития пчелиных семей феромонным препаратом «Апимил»;

  5. пролонгированная и повышенная аттрактивность роепривлекающего препарата «Апимил-М»;

  6. противоварроатозное действие препарата «Апимил» и терапевтический эффект препарата ТОС-3 против болезней расплода медоносных пчел;

  7. новые эффективные способы подсадки пчелиных маток и посадки роев в улей с помощью препаратов ТОС-3 и «Апимил-М»;

  8. аттрактивность препаратов Аписил, Апимил и ТОС-3 для трутней при отсутствии в зоне их лета молодых маток в условиях изолированного случного пункта на расстояниях менее 50 м от пасеки и на высотах значительно меньше 5 м.

^ 1.5. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на III Международной научно-практической конференции «Интермед-2002» (Москва, 2002 г.), Международной научно-практической конференции «Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО» (Уфа, 2003 г.), V Международной научно-практической конференции и Координационном совещании по пчеловодству (Москва, 2004 г.), Международной научно-практической конференции «Биологические науки в XXI веке: проблемы и тенденции развития» (Бирск, 2005 г.) и на XIV Всероссийской конференции «Успехи апитерапии» (Рыбное, 2009), на расширенном заседании кафедры биологии, пчеловодства и охотоведения Башкирского государственного аграрного университета (октябрь 2009).

1.6. Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 14 статьях в журналах, рекомендованных ВАК, в 47 статьях региональной печати, тезисах 6 докладов и в 1 методическом пособии. Получено 3 патента РФ на изобретения.

^ 1.7. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 296 страницах, содержит 45 таблиц, 4 схемы и 36 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы «Использование феромонных препаратов в пчеловодстве», собственных результатов, включающих описание материалов и методов исследования, обсуждения экспериментальных данных, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, состоящего из 425 источников, в том числе 139 иностранных, и приложения.


^ 2. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1. Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнялась автором лично или под его руководством. Материалы данной диссертации получены в результате исследований, проведенных в 1985-2008 годах на пасеках Учебно-опытного лесхоза Башкирского государственного аграрного университета, а также на базе центральной пасеки Башкирской опытной станции пчеловодства (БОСП), на изолированном случном пункте Казамаш БОСП в Ашинском районе Челябинской области, на пасеках Сосновского района Челябинской области, Бирской государственной социально-педагогической академии и Благовещенского района Республики Башкортостан. Схема проведения опытов указана на рисунке 1.

При создании препаративной формы 9-ОДК в качестве носителя использовали хлопковую тесьму шириной 1 см. Для нанесения на нее 9-ОДК в количестве 1 мг на 1 см длины вещество массой 30 мг растворяли в 20 мл диэтилового эфира. Приготовленным раствором пропитывали тесьму длиной 30 см. Затем тесьма просушивалась, и 9-ОДК оставалась в объеме хлопковой тесьмы. Кроме того, были приготовлены еще 2 феромонные композиции. Первая состояла из смеси равных объемов трех спиртовых растворов: 1%-ного 9-ОДК и 0,01%-ных растворов МЭФУК и МЭФПК. Во второй на две объемные части раствора 9-ОДК приходилось по одной части каждого из эфиров. Для дозировки объема растворов в экспериментах использовали микрошприц емкостью 10 мкл, применяемый в газовой хроматографии.

Исследование влияния 9-ОДК на время образования свищевых маточников проводили методом групп-аналогов. Для этого создали 3 группы по 3 нуклеуса: одна контрольная и две опытные. Нуклеусы каждой группы создали от одной пчелосемьи. Каждый нуклеус имел силу в две улочки.

В нуклеусах было по три соторамки, в том числе одна с расплодом старших возрастов. Рамка с печатным расплодом подбиралась такая, чтобы по краям



печатного расплода имелся открытый расплод с однодневными личинками, на которых пчелы могли бы заложить свищевые маточники. В опытных нуклеусах сразу после их образования размещали в верхней части гнезда тесьму с феромоном длиной в 3 см в первой опытной группе и длиной в 1 см во второй опытной группе. В первой половине опытов изучали время образования свищевых маточников. Во второй половине – свищевые маточники уничтожались, после чего изучали прием неплодных маток в нуклеусы и сроки их начала яйцекладки.

При исследовании влияния 9-ОДК на яйценоскость маток и летную деятельность пчел создали 2 группы семей аналогов по 5 пчелосемей в каждой – контрольную и опытную. В опытной группе в каждую пчелиную семью установили в верхней части гнезда между рамок полоски тесьмы с феромоном длиной в 2 см. В опыте изучали количество печатного расплода через 12 дней, а также летную деятельность пчел на вторые сутки после раздачи препарата.

Испытание 9-ОДК на аттрактивность проводилось с использованием 8 см тесьмы, пропитанной феромоном, которая подвешивалась на высоте 2,5 м от земли на стволе дерева в 10 м от пасеки. Дерево было сухостойным и находилось в зоне лета пчел. Прямые солнечные лучи могли попадать на тесьму с феромоном. В контроле изучался лет пчел мимо того же дерева за день до постановки тесьмы с феромоном, а также наблюдался лет пчел на следующий день после снятия тесьмы. Аттрактивность изучали по наличию поведенческих реакций пчел на тесьму с феромоном.

В период с 10 по 25 июня 1986 г. провели второй этап из четырех опытов:

в первом опыте изучалось влияние феромонной композиции (1) из смеси равных объемов трех спиртовых растворов (1%-ного 9-ОДК и 0,01%-ных растворов МЭФУК и МЭФПК) на прием личинок на воспитание при выводе маток;

во втором опыте исследовали влияние обработки той же композицией (1) естественных мисочек на роевое состояние пчелиных семей;

в третьем опыте была поставлена цель – установить влияние феромонной композиции (2), состоящей из двух объемных частей раствора 9-ОДК и одной части каждого из эфиров МЭФУК и МЭФПК, на слет роев;

цель четвертого опыта состояла в том, чтобы изучить влияние обработки феромонной композицией (1) на прием подсаживаемых в отводки неплодных маток.

В опытах по подсадке маток с предварительной обработкой пчел ТОС-3 1 мл препарата растворяли в 1,5 л дистиллированной воды. Опыты проведены в производственных условиях на 4-храмочных пакетах карпатской породы на пасеках Сосновского района Челябинской области. Подсаживаемые плодные матки были линии №77 карпатской породы. Сущностью и новизной работ была предварительная дополнительная обработка всех пчел водным раствором феромона опрыскиванием всех улочек и верхних брусков рамок с помощью «Росинки» из расчета в первый день 5 мл, на второй – 10 мл, на третий – 20 мл, в контрольной группе вместо раствора феромона использовали дистиллированную воду. При наличии свищевых маточников последние удалялись.

Силу семей определяли в улочках путем подсчета числа сотов, полностью занимаемых пчелами. Медопродуктивность семей пчел за сезон оценивали путем взвешивания каждого сота пружинными весами с вычетом массы самого сота и рамки. Летную деятельность пчел определяли путем подсчета количества прилетающих пчел за три минуты с трехкратной повторностью.

Для учета летной активности пчел применяли запись на видеокассету с последующим просмотром в режиме замедленного воспроизведения и электронный счетчик движущихся предметов на инфракрасных лучах в сочетании с однопроходным пчелоудалителем.

В опытах по влиянию препарата ТОС-3 на массу новорожденных пчел и яйцекладку маток 1 мл препарата растворяли в 300 мл 50%-го сахарного сиропа и скармливали пчелам по 5, 10 и 20 мл. В контроле вместо ТОС-3 использовали 1 мл этилового спирта.

Массу новорожденных рабочих пчел измеряли взвешиванием на весах ВЛР-200. Для получения новорожденных рабочих пчел печатный расплод на выходе изолировали в термостат с температурой 34±1˚С.

Опыты по влиянию феромона матки на массу новорожденных пчел выполняли на свежеотстроенных сотах. Учет яйцекладки маток и количества печатного расплода проводили с помощью рамки-сетки со сторонами квадратов 5 см. Для удобства в работе при измерении числа квадратов на сот с наложенной сеткой накладывали бумагу-кальку и наносили на нее контуры границ ячеек с отложенными яйцами или с запечатанным расплодом. На соте эти же границы для последующих работ помечали мелом. Полученное число квадратов умножали на сто и получали конечное числовое значение.

В предварительных опытах 2002 г. каждой из 6 больных американским гнильцом пчелосемей скормили трехкратно с интервалом 3 дня по 0,5 л 50 %-ного сахарного сиропа, содержащего 2 мл препарата ТОС-3. Расплод во всех семьях был несплошной, что характерно для старых маток возрастом больше двух лет или наблюдается при близкородственном разведении (Д.В.Шаскольский, 1977).

Во время летнего сезона 2003 г. аналогичные эксперименты были продолжены. Для этого было выбрано 15 заболевших европейским гнильцом пчелиных семей, разделенных на три группы. Больных пчел 1 группы подкармливали однократно 2 мл препарата ТОС-3 в 100 мл 50 %-ного сахарного сиропа; пчелосемьи второй группы – двукратно; третьей группы – трехкратно с интервалом 5 дней. В дальнейшем во всех семьях произвели замену маток на молодых, удалили соты, на которых ранее наблюдались признаки болезни расплода, семьи пересадили в продезинфицированные ульи. Степень поражения расплода фиксировали с помощью цифровой фотосъемки, определяя количество больных личинок на один расплодный сот (В.Р.Туктаров, Н.С.Чернов, Р.Н.Чернов, 2000).

Измерение экстерьерных признаков проводили согласно общепризнанным методикам В.В.Алпатова, 1948; Г.Д.Билаш, Н.И.Кривцова, 1983. К чистопородным пчелиным семьям относили те, у рабочих особей которых кубитальный индекс равнялся 60% и более, к помесным, соответственно, менее 60%. Для определения кубитального индекса крыла использовали микроскоп МБУ-4А с окулярмикрометром на 60 единиц и ценой деления 0,01 мм.

Объектом исследований служили особи пчел и пчелиные семьи среднерусской породы, а также семьи-помеси. Пчелиные семьи находились в типовых 12-рамочных ульях и имели одинаковые условия кормления и содержания.

Опыты по изучению влияния феромонных препаратов на стимуляцию развития пчел проводили в семьях, подобранных по принципу семей-аналогов (Я.Л.Шагун, 2000). 1 Мл препарата «Аписил» разводили в 100 мл сахарного сиропа, 10 мл этого маточного раствора вносили в 300 мл предлагаемого сахарного сиропа. Препарат «Апимил» (20 г геля или его спиртовой концентрат) также разводили в 100 мл сахарного сиропа и 10 мл данного раствора вносили в 300 мл сахарного сиропа, количество 9-ОДК в составе препарата «Апимил» было эквивалентно количеству 9-ОДК в препарате «Аписил» в расчете на одну пчелиную семью. Первую опытную группу пчелиных семей подкармливали 50 %-ным сахарным сиропом с добавлением препарата «Аписил», вторую – аналогично первой, но с добавлением «Апимила». Третья контрольная группа семей пчел получала чистый сахарный сироп. Для весеннего наращивания семей пчел подкормку производили двукратно с интервалом в 7 дней, для осеннего наращивания семьи пчел подкармливали трехкратно с интервалом в 5 дней.

Оценку хозяйственно полезных признаков пчелиных семей (результатов весенне-осеннего развития, зимовки и продуктивности) проводили согласно рекомендациям А.В.Бородачева и др. (2002).

Воскопродуктивность определяли по количеству отстроенных рамок с вощиной.

Для опытов по оценке воздействия на клещей Варроа препарата «Апимил» отобрали две группы по 5 пчелиных семей в каждой. Для определения степени заклещеванности до и после применения препарата «Апимил» использовали метод «эфир-диагностики» варроатоза (А.В.Бородачев и др., 2002). Открытую чистую сухую колбу на 250 мл горлышком прислоняли к верхнему летку улья так, чтобы исключить боковые проходы для пчел. Легким постукиванием прислоненной колбой у летка возбуждали пчел в улье, которые устремлялись на выход и заходили в колбу. По окончании отбора пчел колбу закрывали ватно-марлевой пробкой, прикрыв одновременно и леток на 5 мин. На колбе восковым карандашом ставили номер семьи. Из ваты делали комочек величиной с горошину, пинцетом опускали его в эфир и помещали в колбу с пчелами. Через 3 мин все клещи отделялись от пчел, и мертвые прочно прилипали к стеклу колбы. Встряхнув 3-4 раза, колбу открывали, высыпали пчел на лист бумаги и подсчитывали количество клещей в колбе и количество пчел на бумаге. Заклещеванность или степень (С) поражения пчелиной семьи при варроатозе выражали в процентах, которую определяли делением количества клещей (К) на количество пчел (П), учтенных при исследовании пробы и умножением результата на 100:

С = ∙ 100 %

Эффективность проведенного лечения (Э) по степени заклещеванности пчел выражалась в процентах и определялась делением разности процентов заклещеванности после (Л) и до лечения (Д) на процент заклещеванности до лечения и умножением результата на 100:

Э = ∙ 100 %

Препарат «Апимил» использовали следующим образом: стандартную упаковку (40 г) разводили в 1,5 л дистиллированной воды. В первой половине июня производилась обработка всех пчел опытной группы водным раствором феромона опрыскиванием всех улочек и верхних брусков рамок с помощью «Росинки» из расчета 20 мл на семью трехкратно с интервалом 5 дней. Семьи контрольной группы обрабатывались дистиллированной водой.

В опытах по подсадке маток с предварительной обработкой пчел «Апимилом» или «Апимилом-М» растворяли стандартную упаковку препарата (40 г) в 1,5 л дистиллированной воды. Пчел и верхние бруски рамок опрыскивали с помощью «Росинки» из расчета 20 мл на семью три раза с интервалом в 12 ч. При наличии свищевых маточников последние удалялись. При другом способе подсадки маток гель препарата «Апимил-М» наносили на верхние бруски рамок и на брюшко матки. К семьям-помесям подсаживали чистопородных среднерусских маток. Опыты проводились на безматочных 4-х рамочных нуклеусах и на безматочных отводках.

Аттрактивность испытуемых смесей при исследовании привлекательности препарата «Апимил» путем введения различных микродобавок, а также при сравнении препаратов «Апимил» и «Апимил-М», определяли измерением массы прилетающих пчел на стеклянные пластинки, обработанные 0,01 г препаратов. Эксперименты проводились во время привесов контрольного улья порядка 0,2 кг в день. Измерение массы проводили на лабораторных квадрантных весах ВЛКТ-500г-М с интервалом 5 минут. Количество привлеченных пчел вычисляли путем деления их массы на 0,1 г.

При испытании феромонной композиции «Апимил-М» на привлечение пчелиных роев препарат в виде геля массой 1 г помещался в открытую стеклянную посуду (диаметр открытой поверхности ~ 15 мм) и подвешивался в верхней части роевни. В качестве контроля использовали препарат «Апимил» в таком же количестве. Роевни развешивали в 3 м от земли со стороны преобладающей розы ветров в пределах 100-800 м от места расположения пасеки. Было развешено 5 групп по две роевни с препаратами «Апимил» и «Апимил-М», расстояние между роевнями в группах составляло 15-20 м.

Все экспериментальные данные получены в опытах, проведенных в трех-пяти сериях.

Цифровой материал подвергнут статистической обработке (Н.А.Плохинский, 1969) на ПЭВМ типа IBM PX – 233 по разработанным программам в вычислительном центре Башкирского ГАУ. При обработке результатов исследований использовали компьютерные программы Microsoft Excel Statistica 6.0.

Для оценки экономической эффективности применения феромонных препаратов при производстве продукции пчеловодства использовали рекомендации И.А.Минакова и др. (2004). Для контроля состояния пчелиных семей применяли радиомикрофон (К.А.Тамбовцев, 2009).

^ 2.2. Результаты и обсуждение

2.2.1. Синтез 9-оксо и 10-гидрокси-2Е-деценовых кислот

Исходя из аллила бромистого и 1,7-октадиена предложены два подхода к синтезу 9-оксо- и 10-гидрокси-2Е-деценовых кислот с использованием хемо- и региоселективных трансформаций общего промежуточного строительного блока – 7-октен-1-илацетата.1

^ 2.2.2. Синтез феромона расплода

Предложен синтез 1-пальмитоил-2,3-диолеоилглицерина – рацемического аналога компонента феромона расплода медоносных пчел исходя из 1,2-О-изопропилиденглицерина.2

^ 2.2.3. Синтез 13-гидрокси-2-оксотридекана

13-Гидрокси-2-оксотридекан, выделенный из экстракта плодов медоноса Evodia hupehensis Dode и активно привлекающий медоносных пчел, синтезирован на основе озонолиза 1-метилциклододецена и тетрадец-13-ен-2-она – продукта моноалкилирования ацетоуксусного эфира 1-бром-10-ундеценом и последующего декарбоэтоксилирования – с дальнейшим восстановлением промежуточных перекисных продуктов с помощью трисацетоксиборгидрида натрия.3

^ 2.2.4. Синтез 2,2,3-триметил-4Е-гексеналя

2,2,3-Триметил-4Е-гексеналь синтезирован исходя из изомасляного альдегида, согласно4.


2.2.5. Многофункциональный феромонный препарат ТОС-3

2.2.5.1. Биологические свойства 9-оксо-2Е-деценовой кислоты и её

композиций с метиловыми эфирами фенилуксусной и фенилпропионовой кислот и синтетическими компонентами феромона железы Насонова

После синтеза полифункционального феромона пчелиной матки (9-ОДК) на первом этапе исследований ставилась цель – установить влияние 9-ОДК (нанесенной на хлопковую тесьму) на состояние пчелиных семей: опыт (1) – на скорость образования свищевых маточников; опыт (2) – на приём матки и скорость её оплодотворения; опыт (3) – на улучшение воспроизводительной функции матки, а также исследовать препарат в качестве полового аттрактанта – опыт (4).

Пары феромона с поверхности тесьмы не оказывали ингибирующего влияния на закладку свищевых маточников в нуклеусах, не давали ожидаемого улучшения приема маток. В третьем опыте препарат не оказывал никакого видимого влияния на яйценоскость маток, а летная деятельность пчелиных семей не зависела от наличия в гнезде хлопковой тесьмы с феромоном. Результаты четвертого опыта заслуживали внимания. Через 10-15 минут после закрепления на стволе дерева тесьмы с феромоном наблюдали следующее. Сначала одна-две, а через некоторое время 4-5 пчел начинали кружиться вокруг дерева, а через 0,5 ч наблюдалось большое скопление летных пчел. В течение длительного времени (6-8 ч) они не покидали пространства около дерева. Иногда пчелы садились на ствол дерева, его ветки, а также около тесьмы с феромоном и на тесьму.

Анализы результатов первых опытов и литературных данных показали, что для управления физиологическим состоянием пчелиных семей необходимо применять более высокие дозы феромона [например, Н.М.Селиванова (1983) в своих опытах на одну пчелиную семью давала около 50 мл 1% спиртового раствора феромона в сахарном сиропе, или 0,5 г действующего вещества] и наряду с 9-ОДК необходимо одновременно использовать другие компоненты феромона пчелиной матки.

Далее в соответствии с целью исследований на учебной пасеке БГАУ в период с 10 по 25 июня 1986 г. провели второй этап из четырех опытов.

В первом опыте изучалось влияние феромонной композиции (1) из смеси равных объемов трех спиртовых растворов (1%-ного 9-ОДК и 0,01%-ных растворов МЭФУК и МЭФПК) на прием личинок на воспитание при выводе маток. Для этого в каждую семью-приемщицу дали по одной прививочной рамке. Все прививочные рамки имели по три планки, а каждая планка по десять искусственных мисочек. Из трех планок каждой рамки две были опытные, а одна – контрольная. В первой семье-приемщице контрольной была верхняя планка, во второй – средняя, в третьей – нижняя. На опытных планках в каждую мисочку вносили по 0,02 мл препарата(1). Прививку личинок в опытные мисочки производили спустя два часа после полного испарения спирта в мисочках.

Во втором опыте исследовали влияние обработки той же композицией (1) естественных мисочек на роевое состояние пчелиных семей. Опыт проводился во время массового роения пчелиных семей. Пчелиные семьи роились на 7-8 улочках, не освоив даже один корпус двенадцатирамочного улья. В шести пчелиных семьях был произведён учёт отстроенных роевых мисочек. В первой пчелиной семье было 7 мисочек, во второй – 8, в третьей – 6, в четвёртой – 8, в пятой – 9, в шестой – 7. В каждую мисочку вносили по 0,02 мл раствора феромонов. В контрольной группе имелось около 30 пчелиных семей, которые находились в роевом состоянии.

В третьем опыте была поставлена цель – установить влияние феромонной композиции (2), состоящей из двух объемных частей раствора 9-ОДК и одной части каждого из эфиров МЭФУК и МЭФПК, на слет роев. Для решения указанной цели создали две группы пчелиных семей среднерусской породы по 6 семей в контрольной и опытной группах. Силу роев не выравнивали, при посадке в улей они занимали от 5 до 8 улочек. В опытной группе все шесть роев слетали подряд по 2-3 раза. На вощину вновь слетевших роев в опытной группе нанесли дозатором препарат(2) по 1 мл на 1 пчелиную семью. После внесения феромонов рои опытной группы снова посадили в улья. В каждый улей контрольной и опытной групп поставили по одному кормовому соту с запечатанным медом. Количество меда в каждом соте было около двух килограмм.

Вследствие известных причин (Н.Е.Гэри, Ф.К.Бетхер, 1971) поведение при спаривании у пчел очень трудно изучать. Уже давно применяется инструментальное осеменение пчелиных маток (В.В.Тряско, 1958), но по качеству искусственно осемененные матки уступают естественно спарившимся. Однако успешная селекция медоносных пчел невозможна без контролируемого спаривания. В связи с этим большое значение имеет разработка действенных методов, которые позволят проводить изучение поведения у медоносных пчел при спаривании, а также контролировать его в селекционной работе (И.Кулинчевич, 1970). Ранее было установлено (Дж.Б.Фри, 1970, Ф.Руттнер, 1972), что, покидая улей, трутни собираются вместе и непрерывно летают в ограниченном пространстве диаметром от 30 до 200 м и на высоте от 10 до 30 м от поверхности земли. Излюбленное ими место трутни используют в течение всего сезона их летной деятельности. Запах летящей матки может привлечь трутня на расстоянии 60 м, хотя ввиду слабости его зрения, он должен приблизиться к матке на расстояние 1 м, чтобы увидеть ее. Изучена относительная привлекательность отдельных компонентов мандибулярного феромона пчеломаток для трутней (G.M.Loper, J.Kochansky, 1996). Одним из способов контролируемого спаривания у медоносных пчел является создание изолированных случных пунктов, которые пространственно удалены от посторонних пчелиных семей. Некоторые матки спаривались более чем за 5 км от места своего размещения, а наибольшая дальность полета трутней равна, по крайней мере, 7 км, следовательно, максимальное расстояние до места спаривания равно более 12 км (Г.Руттнер, Ф.Руттнер, 1972). Опыты по спариванию в изоляторах из металлической сетки (И.Н.Мадебейкин, 1977) или марли размерами 6,0-28*3,0-3,5*3,0 м дали отрицательные результаты. Известно (З.Ю.Скиркявичене, 1988; Z.Skirkeviciene, 1991; А.Скиркявичюс, З.Скиркявичене, 2000), что при отсутствии матки чувствительность обонятельных рецепторов рабочих особей к ее феромону увеличивается в 100-1000 раз. Цель четвертого опыта состояла в том, чтобы изучить влияние феромонной композиции (1) на основе 9-ОДК на спаривание принятых неплодных маток, а также реакцию трутней в условиях изолированного случного пункта при отсутствии в зоне их лета неплодных маток.

На брюшко матки наносили микрошприцем по 0,02 мл раствора. Раствор наносили в полной дозе за 3-4 раза, каждый раз дожидаясь полного высыхания спирта на брюшке матки. После окончания обработки феромонами матки в клеточках Титова подсаживались в отводки по обычной методике. Отверстие в клеточке Титова закрывалось вощиной для того, чтобы пчелы могли сами выпустить матку. Сформированные отводки имели по 4 сота, из которых 2 с печатным расплодом, а также два с кормом. Открытый расплод в отводках отсутствовал. Отводки были на трех улочках. Для проведения второй части четвертого опыта 19 июня 2000 года на изолированный случной пункт Казамаш Башкирской опытной станции пчеловодства АН РБ, находящийся в Ашинском районе Челябинской области и удаленный более чем за 30 км от ближайших пчелосемей, было завезено 9 отцовских семей, которые по всем признакам можно было считать чистопородными среднерусскими (среднеевропейские, темные лесные, собственно медоносные – Apis mellifera mellifera). Маток к этому моменту на пункте не было. Их привезли и подсадили в нуклеусы только на четвертые сутки.

Результаты первого опыта по обработке феромонами искусственных мисочек показаны в таблице 1.


Таблица 1. Влияние феромонной композиции (1) на прием личинок

при искусственном выводе маток (М±m, n=5)




пчел.

семьи


Расположение

планки


Назначение

планки

Количество

мисочек, шт.

Количество принятых

личинок, шт.

Доза феромонов,

мл

1

верхняя

Контрольная

10

9±0,45

-

средняя

Опытная

10

2±0,32

0,02

нижняя

Опытная

10

0

0,02

2

верхняя

Опытная

10

3±0,32

0,02

средняя

Контрольная

10

6±0,55

-

нижняя

Опытная

10

0

0,02

3

верхняя

Опытная

10

2±0,32

0,02

средняя

Опытная

10

2±0,45

0,02

нижняя

Контрольная

10

4±0,55

-


Анализ данных показывает, что из 90 личинок было принято в среднем 28 штук. В опытных планках принято 15% личинок, в контрольных – 63,3%, или на 48,3% больше, чем в опытных при коэффициенте достоверности равном 5,53. Причем для Р = 0,05 при 30 степенях свободы (количество мисочек в прививочной рамке) Td равно 2,042 (Г.Ф.Лакин, 1968). Значит, полученные результаты достоверны, и тенденция к понижению приема личинок очевидна.

Статистически достоверный отрицательный результат этого опыта навел на мысль о том, что эффект уменьшения приема личинок на воспитание должен наблюдаться также и при обработке естественных роевых мисочек.

Анализ данных, полученных во втором опыте по обработке феромонами естественных роевых мисочек, показал, что в опытной группе пчелиных семей не наблюдался вывод роевых маток. Пчелы не отстраивали новых роевых мисочек, а на обработанных мисочках появлялась побелка воском. В контрольной группе в течение всего времени опыта пчелы роились. Дальнейшие исследования в течение целого ряда лет подтвердили указанные выше экспериментальные данные. Роевой инстинкт при обработке раствором феромонов роевых мисочек существенно угасает, в последующем в этих семьях происходит “тихая“ смена матки.

В опыте № 3 со слетом пчелиных роев в течение опытного периода из шести посаженых роев контрольной группы пять слетело. В опытной группе, где использовали раствор феромонов (2), слетело только 2 роя, что на 50% меньше, чем в контрольной группе.

В опыте № 4, проводимом в течение ряда лет с 1986 по 2003 год, нами были накоплены данные о количественных показателях улучшения облета маток при их обработке феромонной композицией (1) на основе 9-ОДК. Установлено, что в среднем около 60-70 % от числа подсаженных маток, обработанных феромонным препаратом ТОС-3, начинали откладывать оплодотворенные яйца после удачного облета, тогда как без обработки феромонами обычно в среднем оплодотворяется только третья часть подсаженных неплодных маток (табл. 2). Это можно объяснить большей аттрактивностью обработанных маток для трутней, вследствие чего они имеют большие шансы к оплодотворению. Таким образом, предварительная обработка неплодных маток феромонами повышает процент облета в 2 раза с высокой степенью достоверности (Р > 0,999). Следует иметь ввиду, что если на брюшко матки нанести сразу всю дозу спиртового раствора (1), то она может погибнуть. Не следует обрабатывать также молодых маток со слабой пигментацией тела. Эта проблема решается уменьшением концентрации этанола или смешиванием препарата с медом. Полученные результаты легли в основу создания многофункциональных феромонных препаратов ТОС-3 и "Апимил-М".


Таблица 2. Влияние предварительной обработки неплодных маток препаратом ТОС-3 на их прием и облет (М±m, Сv %, n=5)





контроль

опыт

год

Облет, шт. (%)

Прием, шт.

Облет, шт. (%)

Прием, шт.

1981

30 (41,1)

73

-

-

1982

21 (32,8)

64

-

-

1985

29 (32,2)

90

-

-

1986

3 (25)

12

6 (60)

10

1991

13 (26)

50

37 (74)

50

2001

7 (35)

20

14 (70)

20

2002

25 (25)

100

57 (57)

100

2003

9 (30)

30

19 (59,4)

32

Σ

137

439

133

212

М (n=8)

30,4

97,5

29,5

47,1

%

31,2




62,7




М (n=5)

64,08




28,20




±m

3,33




1,93




Сv

11,63




15,33




td

9,31










Р

***











^ Примечание: здесь и далее * - Р>0,95; ** - Р>0,99; *** - Р>0,999


По второй части четвертого опыта нами установлено, что в течение первых трех суток, когда в зоне лета трутней не было молодых маток (до привоза пасеки лета диких пчел также не наблюдали) – трутни подлетали к феромонной композиции (1) на основе 9-ОДК, которая находилась на расстоянии 50 м от пасеки на высоте 1 м, хотя известно, что трутни не реагируют на матку, если она находится в пределах 150 м от пасеки и на высоте менее 5 м (J.L.Williams, 1987). Через четверо суток после подсадки неплодных маток в нуклеусы указанные выше явления прекратились: не наблюдалась реакция трутней на ту же феромонную композицию, находящуюся на расстоянии 50 м от пасеки, но на высоте 6 м.

Вероятно, наблюдавшиеся аномальные явления можно объяснить увеличением чувствительности обонятельных рецепторов трутней к феромону матки при отсутствии неплодных маток, что согласуется с результатами исследований литовских ученых (Z.Skirkeviciene, A.Skirkevicius, 1994). Итак, в данных условиях указанные выше параметры относительно мест сбора трутней и расстояний могут меняться. Это, по нашему мнению, открывает новые возможности для наблюдения за спариванием маток в аномально близких от пасеки расстояниях.


^ 2.2.5.2. Новый способ противороевой обработки пчелиных семей


На основании предыдущих опытов по обработке искусственных мисочек, применяемых в матководстве, и естественных мисочек, появляющихся в пчелиных семьях в период подготовки к роению, был разработан запатентованный способ противороевой обработки пчелиных семей. Сущность изобретения состоит в том, что в период появления в семье трутневого расплода и массового выхода трутней в семью вносят феромонный препарат определенного состава, обрабатывая им каждую свободную от яиц и личинок роевую мисочку.

Ранее был известен способ противороевой обработки пчелиных семей (на примере среднерусской породы пчел) синтетическим феромоном, представляющим смесь (1:1:1 по объему) 1%-ного раствора 9-ОДК, 0,1%-ного раствора МЭФУК и 0,1%-ного раствора МЭФПК в 96%-ном этиловом спирте, путем нанесения его дважды в сутки в течение 20 дней на деревянные патрончики, помещенные в каждую улочку, в дозе 0,2 мл. В контрольной группе применяли обычные методы ухода. В результате обработки синтетическим феромоном число отроившихся пчелиных семей составляет 3 из 18 (16,7%), а в контрольной группе – 7 из 18 (38,9%).

Основными недостатками известного ранее способа противороевой обработки пчелиных семей являются недостаточно высокая эффективность противороевого действия (Э=38,9%-16,7%=22,2%) и большой расход раствора синтетического феромона в расчете на одну пчелосемью за сезон вследствие высокой кратности обработок и дозы (0,2 мл) раствора феромонов [0,2 мл*10 улочек*20 дней*2(дважды в день)=80 мл].

Предлагаемый нами способ противороевой обработки пчелиных семей представляет собой введение в пчелиную семью синтетического феромона определенного состава в 96%-ном этиловом спирте в дозах 0,02-0,03 мл однократно в роевые мисочки в период появления трутневого расплода и массового выхода трутней. В роевых мисочках должны отсутствовать яйца или личинки. В противном случае необходимо удаление личинок из роевых мисочек без разрушения последних. После разовой обработки синтетическим феромоном пчелиные семьи (20 штук) среднерусской породы не роятся, и на роевых мисочках появляется побелка воском. В контрольной группе, где применяют обычные методы ухода, число отроившихся пчелиных семей составляет 9 из 20 (45%). Следует отметить, что снижение дозы раствора синтетического феромона до 0,01 мл ведет к появлению отроившихся пчелиных семей (3 из 20 (15%)), а повышение дозы свыше 0,03 мл нецелесообразно.

Основными отличиями предлагаемого способа противороевой обработки пчелиных семей являются место нанесения синтетического феромона (роевые мисочки) и его доза (0,02-0,03 мл против 0,2 мл в известном способе), а также ее однократность.

Преимуществами предлагаемого способа противороевой обработки пчелиных семей являются высокая эффективность противороевого действия (Э=45%-0%=45%); малый расход синтетического феромона в расчете на 1 пчелосемью за сезон вследствие разовой обработки и низкой дозы раствора феромона [(0,02-0,03 мл)*(30 роевых мисочек)*1(кратность обработки)=0,6÷0,9 мл раствора]. Кроме того, до наших исследований преимущественно применялась 1% 9-ОДК, а у нас другие концентрации и соотношения феромонов, которые более соответствуют природному составу.


^ 2.2.5.3. Действие ТОС-3 на пчелиные семьи в различных стадиях

роевого процесса


Для выявления наличия противороевого действия препарата ТОС-3 использовались пчелиные семьи, находящиеся в трех различных стадиях роевого процесса.

В первую опытную группу подобрали пчелиные семьи, находящиеся в начальной стадии роения. В семьях данной группы пчел в роевые мисочки вносили по одной капле (0,02 мл) противороевого препарата с помощью микрошприца. Во вторую опытную группу соответственно были подобраны пчелиные семьи, находящиеся в развивающейся стадии роевого процесса. В семьях этой группы пчел вырезали маточники, а мисочки и срезанные участки сота обрабатывали противороевым препаратом в той же дозе, что и в первой опытной группе. В третью группу были собраны пчелиные семьи, находящиеся непосредственно в роевом состоянии. В семьях пчел с роевым состоянием срезали маточники и производили обработку противороевым феромоном обрезанные участки сотов.

После обработки противороевым феромоном мисочек и обрезанных участков сотов в пчелиных семьях происходят явления, отражающие как продолжение процесса роения, так и его прекращение. В первой группе пчелосемей, которые находились в начальной стадии роения, после внесения по одной капле в мисочки ТОС-3 наблюдалось разгрызание пчелами мисочек. Однако молодые пчелы данной группы продолжали слабо отстраивать соты из искусственной вощины. Летная деятельность оставалась сниженной. Через 4-5 дней в семьях данной группы повышалась летная активность и усиливалась отстройка сотов. На сотах отмечалось наличие яйцекладки маткой. При повторном осмотре пчелосемей данной группы на 8-12 день установлена отстройка новых маточников, которые были расположены не по краям сотов, а в середине. На 3-4 день после отстройки в мисочках семей пчел данной группы обнаруживали засев. Однако пчелосемьи данной группы не находились в роевом состоянии, так как пчелами продолжалась отстройка искусственной вощины и отмечалась повышенная их летная активность. В последующие сроки через 14-15 дней выявляли выход маток из свищевых маточников. Впоследствии в одной из семей данной группы на 5 день обнаружили матку со шлейфом, который свидетельствовал о благополучной осемененности молодой матки, а в других – сплошной ровный засев, характерный для молодых маток. Во второй группе семей пчел, находящихся в развивающейся стадии роения, после обработки мисочек препаратом на 3 день наблюдалось их уничтожение. В то же время запечатанные маточники оставались неповрежденными, но на них появлялась побелка.

Из запечатанных маточников в соответствии со сроком развития на 6-7 день регистрировали выход молодых маток. Однако в семьях данной группы прекращалось роевое состояние.

В третьей группе семей пчел на месте удаленных роевых мисочек и маточников после обработки ТОС-3 отмечалась побелка данных участков сота. В то же время в семьях пчел этой группы через 3 дня отмечалась отстройка не роевых, а 5-6 свищевых маточников, из которых в последующем через 12 – 13 дней наблюдали выход молодых маток. Анализ жизнедеятельности семей пчел этой группы показал отсутствие признаков роения, хотя в этих семьях отмечалось наличие большого количества трутней половозрелого возраста. Характер засева сотов яйцами на небольших участках свидетельствовал о наличии старых маток. Через 6 дней в гнездах семей третьей группы выявлялось наличие сплошного и ровного засева сотов, что свойственно и характерно только молодым маткам. В контрольных группах семей пчел, которых не подвергали обработке феромоном, наблюдали выход роев в соответствии со сроками развития роевых маток.


^ 2.2.5.4. Влияние препарата ТОС-3 на процесс закладывания

свищевых маточников


Известно, что при внезапной потере матки пчелы обычно закладывают свищевые маточники.

Биологическую активность препарата ТОС-3 в процессе закладывания свищевых маточников изучали на отводках силой 1-4 улочек без маток, но с засевом и расплодом. Опыты начинали через 3 часа после формирования отводка. Препаративные формы ТОС-3 (1 %, 0,1 и 0,01 % по 9-ОДК) в дозе 0,2 мл наносили на деревянные патрончики, представлявшие аналоги пчелиных маток, которые подвешивали между рамками с сотами. В контрольные отводки вместо препарата ТОС-3 давали 96 % этанол. Физиологическим критерием привлекательности синтетического феромона ТОС-3 для пчел являлась реакция выбрасывания хоботка рабочими пчелами и слизывание препарата. Эксперименты по оценке привлекательной способности осуществляли в стеклянных однорамочных ульях в условиях пасек, в теплицах и в комнатных условиях в зимний период. В результате проведенных опытов установлено, что наибольшим физиологическим эффектом обладала 1 % препаративная форма ТОС-3 в дозе 0,2 мл (табл. 3). При этом через 2-3 мин после внесения препарата наблюдалось образование «свиты» рабочих пчел, у которых регистрировалась реакция выбрасывания хоботка и слизывание синтетического аналога феромона пчелиной матки.


Таблица 3. Влияние различных концентраций 9-ОДК в препарате ТОС-3 на количество привлеченных рабочих пчел при нанесении в дозе 0,2 мл на деревянные патрончики (М±m, Сv %, n=5)




гр.


Концентрация 9-ОДК в препарате ТОС-3, %


Стат.

показ.

Количество привлеченных

пчел, шт.

Разность,

(%)
















1

1,00

М

16,80

15,4







±m

0,58










Сv

7,76










td

24,35




2

0,10

М

7,40

6







±m

0,51










Сv

15,41










td

10,61




3

0,01

М

3,60

2,2 (157)







±m

0,24










Сv

15,21










td

6,35




4

контроль

М

1,40

-







±m

0,24










Сv

39,12



Ежеквартальныйотче т эмитента эмиссионных ценных бумаг открытое акционерное общество "Газпром нефть" - страница 9,
18.4. Принципы спортивной тренировки - В. С. Кузнецов теория и методика физического воспитания и спорта,
А. В. Масляков и Сергеев Нюргун,
Словари, справочники, толкователи - страница 15,
А. П. Шихвердиев Проект Корпоративный менеджмент учебное пособие - страница 12,
Сведения об объявленных (начисленных) и о выплаченных дивидендах по акциям ОАО Концерн “КАЛИНА”, а также о доходах по облигациям ОАО Концерн “КАЛИНА”,
4. Інші витрати - Міністерство освіти І науки україни харківська національна академія міського господарства методичні вказівки,
Ежеквартальныйотче т - страница 9,
Глава 6. Курочка по зернышку клюет - Прошлого,
Управления Организации Объединенных Наций по наркотикам и преступности доклад - страница 3,
Собрание сочинений Даниил Хармс. Дневники - страница 46,
Тема 23: Норма права - Преподаватель: Сидоров Василий Петрович,
Министерство транспорта российской федерации федеральный дорожный департамент гп «росдорнии» утверждаю - страница 6,
Глава 5. ДОХОДИ, ВИДАТКИ ТА КРЕДИТУВАННЯ - Бюджетний кодекс україни,
Я книга написана человеком, являющимся одновременно выдающимся ученым и духовным искателем, на основании более чем двадцати лет исследований и духовной практики - страница 40,
Правительства Российской Федерации от 15 декабря 1999 г. N 1396 Собрание закон - страница 40,
Цинская генетика представляет собой область знаний о наследственности и изменчивости человека, имеющих непосредственное отношение к проблемам и задачам медицины - страница 7,
Глава 10. ОРГАНИЗАЦИЯ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОГО УЧЕТА - Конституции Российской Федерации и состоит из Основ закон,
Конференция сторон конвенции о биологическом разнообразии - страница 36,
Немецкий язык с братьями Гримм Сказки братьев Гримм - страница 16,
В. В. Малявина внутренний раздел - страница 18,
61 62 - Евгений Поникаров,
Собрание сочинений в четырех томах. Том Песни. 1961-1970 Текст предоставлен изд-вом - страница 102,
Правительстве Республики Карелия отчет - страница 22,